Método de difusión de disco

Se colocan no más de 6 discos impregnados con antibióticos sobre la superficie de un medio nutritivo denso sembrado sobre un césped continuo con el cultivo de prueba, a una distancia de al menos 2 cm entre sí. Los resultados se registran después de 18-24 horas de incubación en un termostato según el diámetro de la zona de no crecimiento alrededor de los discos con antibióticos. La presencia de crecimiento alrededor del disco indica la insensibilidad de este microbio al antibiótico. Se utilizan tablas especiales para interpretar los resultados.

Figura 1. Determinación de la sensibilidad.

Microorganismos que utilizan el método de difusión en disco:

1 – microorganismo sensible a un antibiótico;

2 – microorganismo moderadamente resistente a un antibiótico;

3 – microorganismo estable a un antibiótico.

método de prueba electrónica

Principio del método. La determinación de la sensibilidad de un microorganismo se lleva a cabo de manera similar a la prueba mediante el método de difusión en disco. La diferencia es que en lugar de un disco de antibióticos, se utiliza una tira reactiva electrónica que contiene un gradiente de concentraciones de antibióticos de máximo a mínimo. En la intersección de la zona elipsoidal de inhibición del crecimiento con la tira reactiva E, se obtiene el valor de concentración mínima inhibidora (CIM).

Figura 2. Determinación de la sensibilidad de los microorganismos mediante pruebas electrónicas.

Método de dilución en serie en medio caldo.

Se preparan diluciones dobles en serie del fármaco antibacteriano en tubos de ensayo que contienen 1 ml de caldo de Mueller-Hinton, por ejemplo 100 µg/ml – 1º, 50 µg/ml – 2º, 25 µg/ml – 3º, 12,5 µg/ml – 4º , etc. Luego se añaden a cada tubo 0,1 ml de la suspensión bacteriana analizada. Al mismo tiempo se administra control de crecimiento (1 ml de caldo Mueller-Hinton y 0,1 ml de suspensión bacteriana). Los cultivos se incuban a 37°C durante 18-24 horas, después de lo cual se anotan los resultados. La ausencia de turbidez en el medio indica un retraso del crecimiento bacteriano en presencia de una determinada concentración del fármaco.

Figura 3. Determinación del valor de MIC por dilución en medio nutritivo líquido

La concentración mínima inhibidora (CMI) es la concentración más baja de un antibiótico (en μg/ml o mg/l) que inhibe completamente el crecimiento bacteriano visible in vitro.

2 Determinación de la sensibilidad de diferentes cepas de estafilococos a los antibióticos utilizando el discos estándar

Antibiótico	Zona de inhibición del crecimiento, mm	Características de la cepa

La cultura en estudio es sensible a ___________________________________________________

moderadamente resistente a ________________________________________________________________________,

resistente a _________________________________________________________________________________.

3 Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) de penicilina mediante el método de dilución seriada.

Conclusión: La CMI de la penicilina para la cepa en estudio es _____________________________________

Ventajas del método:____________________________________________________________________________

Desventajas del método:______________________________________________________________________________

4 Identificación y registro de acción antagónica. diferentes tipos bacterias.

Se inoculan un microbio antagonista y cepas de prueba perpendiculares a él con una raya a lo largo del diámetro en una placa con MPA. Los resultados se registran un día después de la siembra. La presencia y el grado de acción antagonista están determinados por el tamaño de las zonas de inhibición del crecimiento de los cultivos de prueba.

Siembra en línea_________________________________

Conclusión: el mayor efecto antagónico se detectó para las cepas de prueba (especificar especie) ______________________________________________________________________________________________

LECCIÓN No. 8

TEMA: LECCIÓN FINAL DEL TEMA: “ETAPAS HISTÓRICAS EN EL DESARROLLO DE LA MICROBIOLOGÍA, MORFOLOGÍA, FISIOLOGÍA Y GENÉTICA DE LOS MICROORGANISMOS”.

Formas y tamaños de bacterias verdaderas. Características de las formas esféricas, en forma de bastón y convolutas de bacterias verdaderas.

Estructura de las bacterias. Las principales diferencias entre una célula procariota y una célula eucariota.

Pared celular de bacterias grampositivas y gramnegativas.

Tipos de preparaciones microscópicas. Técnica de elaboración de preparados fijos.

Técnica de microscopía en microscopio óptico.

Estudio de la morfología de microorganismos en microscopio electrónico.

Propiedades tintoriales de los microbios. Tintes. Métodos sencillos de tinción de preparaciones fijas.

Principios de clasificación de procariotas patógenos (Burgee, 2001).

Dispositivos protectores en microorganismos.

Esporas, etapas y condiciones de formación de esporas, significado biológico.

Cápsulas bacterianas, su significado.

Flagelos, su estructura. Cilios. Beber sexo.

Espiroquetas.

Posición sistemática y morfología de las espiroquetas. Características de ultraestructura y composición química. Métodos de investigación.

Actinomicetos, morfología, ultraestructura, composición química. Especies patógenas. El papel de los actinomicetos en la naturaleza y la medicina. Métodos de detección.

Taxonomía de clamidia. Morfología, estructura, métodos de detección. Ciclo de desarrollo de clamidia.

Rickettsia, morfología, ultraestructura, composición química. Especies patógenas.

Micoplasmas.

Clasificación. Filogénesis. Métodos de detección.

Formas defectuosas de microbios: protoplastos, esferoplastos, formas L.

Nutrición de bacterias. Los nutrientes son fuentes de carbono y nitrógeno. Clasificación de bacterias por tipo de nutrición Autótrofas y quimioorganótrofas

Factores de crecimiento y sus fuentes. Fuentes de elementos minerales.

Métodos y mecanismos de transferencia de nutrientes a través de la membrana.

Requerimientos energéticos de las bacterias. Formas de obtener energía de los autótrofos (fotosíntesis, quimiosíntesis). Fuentes y formas de obtención de energía en quimioorganotrofos.

Tipos aeróbicos y anaeróbicos de oxidación biológica en bacterias. Bacterias aeróbicas, anaeróbicas, anaeróbicas facultativas y microaerófilas. Métodos para crear condiciones anaeróbicas.

Objetivos, etapas, ventajas y desventajas del método de investigación bacteriológica (cultural).

Crecimiento y reproducción de microorganismos. Métodos de reproducción. Mecanismo de fisión binario (simple). Reproducción de poblaciones bacterianas.

Principios y métodos de cultivo bacteriano.

Necesidades nutricionales de los microbios.

Medios nutritivos para el cultivo de bacterias.

Requisitos para medios nutritivos.

Clasificación de medios nutritivos.

Condiciones y técnicas para el cultivo de bacterias.

Técnica de siembra en medios nutritivos.

Bacteriófagos (fagos). Historia del descubrimiento. Morfología, características estructurales, composición química y propiedades de los fagos.

Fagos virulentos. Fases de interacción con una célula bacteriana. Resultados de la interacción entre fago y célula. Fagos templados. Profago.

El fenómeno de la lisogenia. Conversión de fagos.

Métodos para aislar y valorar bacteriófagos en medios nutrientes sólidos y líquidos. Aplicación de fagos en microbiología y medicina. Diagnóstico de fagos y tipificación de fagos. Herencia. Organización del aparato genético en bacterias (nucleoide, plásmidos, Es

-secuencias, transposones).

Principios de funcionamiento del genoma bacteriano. Organización del operón. Genotipo y fenotipo.

Plásmidos, clasificación, estructura y propiedades de los plásmidos. Plásmido R, características de estructura y función. Plásmidos bacteriocinógenos. Variabilidad microbiana. Modificaciones en las bacterias, significado, principales manifestaciones y propiedades (carácter no hereditario, adaptabilidad, frecuencia alta

cambios directos e inversos, muchos factores inductores).

Variabilidad genotípica. Mutaciones y su clasificación.

Mutágenos. Manifestaciones fenotípicas de mutaciones. El destino de los mutantes. Disociación en bacterias.

La influencia de la selección. Sistema de reparación de daños en el genoma.

Variabilidad de recombinación. Mecanismos de formación de genomas combinados. Frecuencia de cambios en las características individuales.

Transformación, transducción, conjugación.

Importancia práctica del conocimiento sobre la genética de los microbios.

Principios del mapeo genético.

Medicamentos de quimioterapia. Propiedades. Principales grupos de fármacos quimioterapéuticos. Mecanismos de acción sobre las bacterias. El concepto de selectividad y “objetivos” de acción.

Antibióticos.

Definición. Productores de antibióticos.

Antibióticos sintéticos y semisintéticos.

Principales grupos de antibióticos por estructura química. Antibióticos betalactámicos Tetraciclinas. Aminoglucósidos. Macrólidos y azolidos. Ansamicinas (rifampicinas).

Levomicetina. Antibióticos fluoroquinolonas.

Lincomicina. Polimixinas. Glicopéptidos9

TEMA: Clasificación de los antibióticos según el mecanismo de acción sobre la célula bacteriana.

Mecanismos de resistencia de los microorganismos a los fármacos antibacterianos.

Métodos para determinar la sensibilidad de las bacterias a los antibióticos y otros fármacos de quimioterapia. . Técnica para configurar, registrar y evaluar la sensibilidad mediante el método del disco, E-test, diluciones seriadas.

LECCIÓN No.

ECOLOGÍA DE LAS BACTERIAS. INFECCIÓN. MICROORGANISMOS PATÓGENOS. TOXINAS MICROBIANAS. MÉTODO BIOLÓGICO (EXPERIMENTAL).

LISTA DE VERIFICACIÓN

Microflora del cuerpo humano.

Microflora humana normal (residente). Microflora autóctona y alóctona, parietal y luminal.

Formación y desarrollo de microflora normal. Funciones de la microflora normal: antiinfecciosa, metabólica, inmunobiológica, antitóxica.

Clasificación de procesos infecciosos por gravedad, naturaleza del patógeno, fuente de infección, modo de transmisión del patógeno y mecanismo de infección y prevalencia.

Clasificación de procesos infecciosos según la localización del foco microbiano, duración del curso y frecuencia de la infección. Dinámica proceso infeccioso

, sus características.

Método de investigación biológica (experimental), etapas, evaluación. Animales de laboratorio.

Métodos de infección.

TRABAJO DE LABORATORIO 1 Estudio de la microflora normal..

A) Siembra para estudiar la microflora normal de la piel de las manos en medio Endo y agar sangre. método de réplica

Principio del método:

humedecer trozos de papel de filtro estériles de 1x1 cm en una placa de Petri con solución salina estéril. solución. Con unas pinzas esterilizadas, coloque un trozo de papel sobre la superficie de la piel a examinar durante 0,5 minutos. Coloque el papel sobre la superficie del medio nutritivo denso (impresión) durante 1 minuto. Retire el papel. Incubar las placas con impresiones a 37 0 C durante 24-48 horas.

C) Realizar un registro de inoculación de microflora, preparar preparaciones de diferentes tipos de colonias, tinción de Gram, microscopio (en inoculaciones de demostración).

Contabilización de la inoculación de microflora: _______________________ Microscopía de preparaciones: _______________ _______________________

Contabilización de la inoculación de microflora: _______________________ Microscopía de preparaciones: _______________ _______________________

2 Preparación______________Colorante. Evaluación de adhesividadmi

A) Siembra para estudiar la microflora normal de la piel de las manos en medio Endo y agar sangre. coli

por su capacidad de adsorberse en la superficie de los glóbulos rojos

3 El cultivo de prueba de microorganismos se agrega a la suspensión de eritrocitos. Después de la incubación, se preparan frotis, se tiñen y se determina bajo un microscopio el número promedio de bacterias adsorbidas en un glóbulo rojo.

1. En este caso, los glóbulos rojos se utilizan como célula modelo de un microorganismo susceptible.

Determinación de enzimas de invasividad en estafilococos.

2.Plasmocoagulasa

Principio del método: El cultivo problema se añade a un tubo de ensayo que contiene plasma sanguíneo de conejo citratado. Después de la incubación en un termostato, se tiene en cuenta el resultado. Si el resultado es positivo, el plasma coagula (coagula).

3.fibrinolisina

Principio del método: El cultivo de prueba se agrega a un tubo de ensayo con fibrina (un coágulo de sangre lavado de glóbulos rojos). Después de la incubación en un termostato, se tiene en cuenta el resultado. Si el resultado es positivo, el coágulo se disuelve.

4.hialuronidasa

El principio del método: los cultivos de estafilococos aislados se inoculan en agar yema-sal, que contiene un 7,5% de cloruro de sodio y una suspensión de yema. Si el resultado es positivo, se forma un halo de arcoíris alrededor de las colonias de estafilococos virulentos debido a la descomposición de la lecitina contenida en la yema de un huevo de gallina.

Conclusión: (enumerar las enzimas de virulencia de cada una de las dos cepas estudiadas) ________________________________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________________

Toxinas bacterianas

Toxicidad ___________________________________________________________________________________

Toxigenicidad _________________________________________________________________________________

Endotoxina ___________________________________________________________________________________

Choque endotóxico _________________________________________________________________________

Aplicación práctica de las endotoxinas:

Exotoxina ___________________________________________________________________________________

Anatoxina _____________________________________________________________________________________

Esquema de obtención de exotoxinas y toxoides.

1.____________________________________________________________________________________________

2.____________________________________________________________________________________________

4.____________________________________________________________________________________________

Uso práctico de los toxoides:

1.____________________________________________________________________________________________

2.____________________________________________________________________________________________

3.____________________________________________________________________________________________

prueba electrónica) es un método bien establecido para probar la susceptibilidad a los antibióticos en laboratorios de todo el mundo. Se utiliza ampliamente en estudios de resistencia tanto en clínicas de diagnóstico como de pruebas. La prueba es un método cuantitativo para determinar micrófono medicamentos antimicóticos y antibacterianos para agentes infecciosos, incluidos los sépticos, lo cual es especialmente importante para pacientes gravemente enfermos. Actualmente, este método cuenta con más de 100 antibióticos para probar una variedad de bacterias aeróbicas y organismos exigentes como neumococos, Haemophilus influenzae, H. pylori, meningococos, gonococos, anaerobios, hongos y micobacterias. prueba electrónica permite utilizar racionalmente antibióticos que proporcionen los mejores resultados a los pacientes, así como corregir el régimen de tratamiento tras la prescripción empírica de fármacos. La prueba es extremadamente importante para determinar la dosis de antibióticos en pacientes con sitios de infección topográficamente de difícil acceso (p. ej., endocarditis), en algunas infecciones nosocomiales, infecciones crónicas y en pacientes con inmunodeficiencia.

prueba electrónica- tecnología patentada única. Su principio es que se aplican diluciones sucesivas del antibiótico a una tira reactiva de plástico de menor a mayor y permite determinar con precisión, a partir de al menos 15 diluciones, la actividad antimicrobiana de los agentes bacterianos, tanto caprichosos como no.

El procedimiento de prueba es simple: se coloca una tira con un reactivo sobre la superficie de un agar inoculado a partir de una dilución estándar. Después de la incubación, el resultado se lee utilizando una escala de dilución aplicada a la placa en la intersección de la zona de inhibición del crecimiento, en forma de elipse, con la tira reactiva.

prueba electrónica tiene una serie de ventajas en el seguimiento de la resistencia, ya que contiene un gradiente de concentración que puede mostrar los más mínimos cambios en la sensibilidad. La amplitud del gradiente de concentración de esta prueba cubre las variaciones de manera sensible. resistencia de los microorganismos y determina niveles altos y bajos de resistencia.

Esta es la prueba más sensible disponible en la actualidad. prueba electrónica Es un macrométodo que se puede implementar fácilmente en el laboratorio para determinar la sensibilidad. En la era del descubrimiento de infecciones cada vez nuevas y de la creciente resistencia de los microorganismos a los fármacos antibacterianos, prueba electrónica Reconocido mundialmente como una innovación importante en la determinación de la actividad antimicrobiana.

El catálogo de Biomerye 2013 en las páginas 33 - 36 contiene una lista completa de pruebas electrónicas (100 artículos):

• Antibacteriano
• antifúngico
• antituberculosis
• Para determinar la resistencia a múltiples fármacos.

	Nombre	Gato. No.
	antifúngico	20306
		19364
		20307
		20457
		21040
		21053
		21055
		19361
		19362
	El paquete de aluminio contiene un cartucho de espuma con 30 tiras y un desecante; Almacenar a 2-8°C o en una habitación controlada. t°С	19363
	el embalaje es un blister (envase de plástico seccional) que consta de 10 celdas, cada una de las cuales contiene 3 tiras (antibacterianas). Almacenamiento a -20°C	19365
	El envase es un blister (envase de plástico seccional) que consta de 10 celdas, cada celda contiene 3 tiras (antibacterianas). Almacenamiento a -20°C	19366
	El embalaje es un blister (envase de plástico seccional) que consta de 10 celdas, cada una de las cuales contiene 3 tiras (antibacterianas). Almacenamiento a -20°C	19359
	El paquete de aluminio contiene un cartucho de espuma con 30 tiras y un desecante; Almacenar a 2-8°C o en una habitación controlada. t°С	19371
	El paquete de aluminio contiene un cartucho de espuma con 30 tiras y un desecante; Almacenar a 2-8°C o en una habitación controlada. t°С	19375
	El paquete de aluminio contiene un cartucho de espuma con 30 tiras y un desecante; Almacenar a 2-8°C o en una habitación controlada. t°С	19374
	El paquete de aluminio contiene un cartucho de espuma con 30 tiras y un desecante; Almacenar a 2-8°C o en una habitación controlada. t°С	19373
	El envase es un blister (envase de plástico seccional) de 10 celdas, cada celda contiene 3 tiras (antibacterianas). Almacenamiento a -20°C	19372
	El envase es un blister (envase de plástico seccional) de 10 celdas, cada celda contiene 3 tiras (antibacterianas). Almacenamiento a -20°C	19370
	El paquete de aluminio contiene un cartucho de espuma con 30 tiras y un desecante; almacenamiento a 2-8°C o en una habitación controlada. t°С	19360

La conferencia analiza los principales métodos para determinar la sensibilidad. in vitro microorganismos hasta medicamentos antimicrobianos (difusión en disco, pruebas electrónicas, métodos de dilución). Se reflejan los enfoques de la prescripción empírica y etiotrópica de antibióticos en la práctica clínica. Se discuten las cuestiones de la interpretación de los resultados de la determinación de la sensibilidad desde un punto de vista clínico y microbiológico.

Actualmente, en la práctica clínica existen dos principios para la prescripción de fármacos antibacterianos: empírico y etiotrópico. Prescripción empírica de antibióticos basado en el conocimiento de la sensibilidad natural de las bacterias, datos epidemiológicos sobre la resistencia de los microorganismos en la región u hospital, así como los resultados de estudios clínicos controlados. La ventaja indudable de la prescripción empírica de quimioterapia es la posibilidad de un inicio rápido de la terapia. Además, este enfoque elimina el costo de investigación adicional.

Sin embargo, si la terapia antibacteriana en curso es ineficaz, en las infecciones nosocomiales, cuando es difícil adivinar el patógeno y su sensibilidad a los antibióticos, se tiende a realizar una terapia etiotrópica. Prescripción etiotrópica de antibióticos. Implica no sólo aislar el agente infeccioso del material clínico, sino también determinar su sensibilidad a los antibióticos. Obtener datos correctos sólo es posible con la implementación competente de todas las etapas de la investigación bacteriológica: desde la toma del material clínico, su transporte al laboratorio bacteriológico, la identificación del patógeno hasta la determinación de su sensibilidad a los antibióticos y la interpretación de los resultados obtenidos.

La segunda razón de la necesidad de determinar la sensibilidad de los microorganismos a los fármacos antibacterianos es la obtención de datos epidemiológicos sobre la estructura de resistencia de los patógenos de infecciones nosocomiales y adquiridas en la comunidad. En la práctica, estos datos se utilizan en la prescripción empírica de antibióticos, así como para la formación de formularios hospitalarios.

Métodos para determinar la sensibilidad a los antibióticos.

Los métodos para determinar la sensibilidad de las bacterias a los antibióticos se dividen en 2 grupos: métodos de difusión y dilución.

Al determinar la sensibilidad mediante el método de difusión en disco, se aplica una suspensión bacteriana de una determinada densidad (generalmente equivalente a un estándar de turbidez de McFarland de 0,5) a la superficie de un agar en una placa de Petri y luego se colocan discos que contienen una determinada cantidad de antibiótico. . La difusión del antibiótico en el agar conduce a la formación de una zona de supresión del crecimiento de microorganismos alrededor de los discos. Después de incubar las placas en un termostato a una temperatura de 35 o -37 o C durante la noche, el resultado se tiene en cuenta midiendo el diámetro de la zona alrededor del disco en milímetros ().

Figura 1. Determinación de la sensibilidad de microorganismos mediante el método de difusión en disco.

La determinación de la sensibilidad de un microorganismo mediante la prueba E se lleva a cabo de manera similar a la prueba mediante el método de difusión en disco. La diferencia es que en lugar de un disco con un antibiótico, se utiliza una tira reactiva electrónica que contiene un gradiente de concentraciones de antibióticos de máximo a mínimo (). En la intersección de la zona elipsoidal de inhibición del crecimiento con la tira reactiva E, se obtiene el valor de concentración mínima inhibidora (CIM).

Figura 2. Determinación de la sensibilidad de los microorganismos mediante pruebas electrónicas.

La indudable ventaja de los métodos de difusión es la facilidad de realización de las pruebas y la accesibilidad en cualquier laboratorio bacteriológico. Sin embargo, dado el alto coste de las pruebas electrónicas, el método de difusión por disco se suele utilizar para trabajos de rutina.

Métodos de reproducción se basan en el uso de diluciones seriadas dobles de concentraciones de antibióticos de máxima a mínima (por ejemplo, de 128 μg/ml, 64 μg/ml, etc. a 0,5 μg/ml, 0,25 μg/ml y 0,125 μg/ml). En este caso, el antibiótico en diversas concentraciones se añade a un medio nutritivo líquido (caldo) o agar. Luego se coloca una suspensión bacteriana de cierta densidad, correspondiente al estándar de turbidez de McFarland de 0,5, en un caldo antibiótico o en la superficie de una placa de agar. Después de la incubación durante la noche a una temperatura de 35 o -37 o C, se registran los resultados obtenidos. La presencia de crecimiento de microorganismos en el caldo (turbidez del caldo) o en la superficie del agar indica que la concentración dada de antibiótico es insuficiente para suprimir su viabilidad. A medida que aumenta la concentración de antibióticos, se deteriora el crecimiento del microorganismo. Se considera que la primera concentración más baja de antibiótico (de una serie de diluciones seriadas), cuando el crecimiento bacteriano no se determina visualmente, es concentración mínima inhibitoria (CIM). La CIM se mide en mg/l o μg/ml ().

Figura 3. Determinación del valor de MIC por dilución en un medio nutritivo líquido.

Interpretación de los resultados de sensibilidad.

Según los datos cuantitativos obtenidos (diámetro de la zona de inhibición del crecimiento del antibiótico o valor MIC), los microorganismos se dividen en sensibles, moderadamente resistentes y resistentes (). Para distinguir entre estas tres categorías de sensibilidad (o resistencia) se utiliza el llamado concentraciones límite(punto de interrupción) antibiótico (o valores límite del diámetro de la zona de inhibición del crecimiento de microorganismos).

Figura 4. Interpretación de los resultados de la determinación de la sensibilidad de las bacterias según los valores de MIC.

Las concentraciones límite no son valores inmutables. Podrán revisarse dependiendo de los cambios en la sensibilidad de la población microbiana. El desarrollo y revisión de los criterios de interpretación está a cargo de destacados especialistas (quimioterapeutas y microbiólogos) que son miembros de comités especiales. Uno de ellos es el Comité Nacional de Estándares de Laboratorios Clínicos de EE. UU. (NCCLS). Actualmente, los estándares NCCLS son reconocidos en todo el mundo y se utilizan como estándares internacionales para evaluar los resultados de la determinación de la susceptibilidad de las bacterias en estudios microbiológicos y clínicos multicéntricos.

Hay dos enfoques para interpretar los resultados de susceptibilidad: microbiológico y clínico. La interpretación microbiológica se basa en el análisis de la distribución de concentraciones de antibióticos que suprimen la viabilidad de las bacterias. La interpretación clínica se basa en la evaluación de la eficacia de la terapia con antibióticos.

Microorganismos sensibles (susceptibles)

Clínicamente, las bacterias se clasifican como sensibles (teniendo en cuenta los parámetros obtenidos in vitro), si al tratar infecciones causadas por estos microorganismos con dosis estándar de un antibiótico se observa un buen efecto terapéutico.

En ausencia de información clínica confiable, la división en categorías de sensibilidad se basa en una contabilidad conjunta de los datos obtenidos. in vitro y farmacocinética, es decir de las concentraciones de antibióticos que se pueden alcanzar en el lugar de la infección (o en el suero sanguíneo).

Microorganismos resistentes

Las bacterias se clasifican como resistentes (resistentes) cuando, en el tratamiento de una infección causada por estos microorganismos, la terapia no produce ningún efecto, incluso cuando se utilizan dosis máximas de antibióticos. Estos microorganismos tienen mecanismos de resistencia.

Microorganismos con resistencia intermedia (intermedia)

Clínicamente, la resistencia intermedia en las bacterias está implícita cuando las infecciones causadas por dichas cepas pueden tener diferentes resultados terapéuticos. Sin embargo, el tratamiento puede tener éxito si el antibiótico se usa en una dosis superior a la estándar o si la infección se localiza en un área donde el fármaco antibacteriano se acumula en altas concentraciones.

Desde el punto de vista microbiológico, las bacterias con resistencia intermedia incluyen una subpoblación que, de acuerdo con los valores de CMI o diámetros de zona, se sitúa entre los microorganismos sensibles y resistentes. A veces, las cepas de resistencia intermedia y las bacterias resistentes se combinan en una categoría de microorganismos resistentes.

Cabe señalar que la interpretación clínica de la sensibilidad bacteriana a los antibióticos es condicional, ya que el resultado de la terapia no siempre depende únicamente de la actividad del fármaco antibacteriano contra el patógeno. Los médicos conocen casos en los que, según una investigación, los microorganismos son resistentes in vitro, recibió un buen efecto clínico. Por el contrario, si el patógeno es sensible, la terapia puede resultar ineficaz.

En determinadas situaciones clínicas, cuando los resultados de las pruebas de sensibilidad mediante métodos convencionales son insuficientes, se determina la concentración bactericida mínima.

Concentración mínima bactericida (MBC)- la concentración más baja de antibiótico (mg/l o μg/ml) que durante el estudio in vitro Provoca la muerte del 99,9% de los microorganismos desde el nivel inicial durante un determinado periodo de tiempo.

El valor de MBC se utiliza en el tratamiento con antibióticos que tienen un efecto bacteriostático o en ausencia del efecto de la terapia antibacteriana en una categoría especial de pacientes. Casos especiales para determinar el CMM pueden ser, por ejemplo, endocarditis bacteriana, osteomielitis o infecciones generalizadas en pacientes con condiciones de inmunodeficiencia.

En conclusión, me gustaría señalar que hoy en día no existen métodos que permitan predecir con absoluta certeza el efecto clínico de los antibióticos en el tratamiento de enfermedades infecciosas. Sin embargo, estos resultados de sensibilidad pueden servir como una buena guía para que los médicos seleccionen y ajusten la terapia antibacteriana.

Tabla 1. Criterios para interpretar la susceptibilidad bacteriana.

Clasificación, enfoques generales de implementación. Métodos de difusión: método del disco de papel, prueba electrónica.

Los métodos para determinar la sensibilidad de las bacterias a los antibióticos se dividen en 2 grupos:
1. Métodos de difusión:
. usando discos de antibióticos
. usando pruebas electrónicas
2. Métodos de dilución en serie:
. dilución en medio nutritivo líquido (caldo)
. dilución en medio agar
Los métodos para determinar la sensibilidad se desarrollaron en la segunda mitad de los años 60 y principios de los 70 del siglo XX y desde entonces no han sufrido cambios fundamentales desde un punto de vista metodológico.
Los siguientes pasos son comunes a todos los métodos:
- preparación y control de calidad de medios nutritivos.
- preparación de una suspensión de microorganismos de prueba (inóculo)
- inoculación
- para métodos de difusión: la etapa de aplicación de discos o tiras de prueba E a un medio nutritivo sólido.
- incubación
- registro e interpretación de resultados
- formulación de recomendaciones de tratamiento
Los métodos de difusión se basan en la difusión de un fármaco antibacteriano (ABP) desde un portador a un medio nutritivo sólido inoculado con un microorganismo y registrando el diámetro de la zona de inhibición (retraso) del crecimiento del microorganismo en estudio.
. El método es menos sensible y menos preciso que el método de dilución en serie, pero se utiliza con más frecuencia en la práctica debido a su simplicidad. Publicado en ref.rf.
. La velocidad de difusión de cualquier fármaco en agar depende de su estructura, peso molecular, presencia de impurezas, composición y pH del medio.
Método de discos de papel con antibiótico (método de difusión en disco).
. Para llevar a cabo este método utilice ruedas estándar, que contiene una cierta cantidad de antibióticos y un medio nutritivo estándar necesario para el crecimiento de este tipo de microorganismo. Dentro de ciertos límites, el diámetro de la zona de inhibición del crecimiento es inversamente proporcional a la MIC. . Se aplica una suspensión bacteriana de cierta densidad a la superficie del agar en una placa de Petri. . Se colocan discos que contienen una determinada cantidad de antibiótico. . Incubar en condiciones favorables para cada microorganismo específico. . Los diámetros de las zonas de inhibición del crecimiento alrededor del disco se miden en milímetros (teniendo en cuenta el diámetro del disco). . El resultado se evalúa utilizando una tabla especial comparando el diámetro de las zonas de inhibición del crecimiento del cultivo probado con los valores límite del diámetro de la zona en la tabla. . La cultura en estudio se clasifica en una de tres categorías: sensible, moderadamente sensible y resistente.

Prueba E (prueba E o método epilométrico)
El método tiene una tecnología similar al método del disco de papel.
. Se utiliza como soporte una tira estrecha de polímero (0,5x6,0 cm), sobre la que se aplica un gradiente de concentraciones de ABP (de mínimo a máximo). Los valores de concentración de ABP en cada sección de la tira están marcados en la superficie exterior (de cara al investigador).
. La inhibición del crecimiento de microorganismos alrededor de la tira portadora ocurre en la zona donde la concentración de antibiótico que se difunde desde el portador es mayor que la MIC.
. En la intersección de la zona elipsoidal de inhibición del crecimiento con la tira reactiva E, se obtiene el valor MIC.
La prueba E combina la simplicidad del método del disco de papel con la precisión del método de dilución en serie.

Métodos utilizados para la evaluación comparativa in vitro de fármacos de terapia antimicrobiana: método de dilución seriada en medios nutritivos líquidos y sólidos.

Métodos de dilución en serie:
. Permiten cuantificar la sensibilidad del microorganismo aislado a agentes antibacterianos y determinar la CMI del fármaco.
. Se utiliza para la evaluación comparativa de la actividad antimicrobiana in vitro del medicamento genérico en desarrollo y el medicamento original.
. Para determinar el valor de CIM, se añaden concentraciones específicas de antibióticos al medio nutritivo, en el que luego se inocula un cultivo del microorganismo en estudio. Después de la incubación, se evalúa la presencia o ausencia de crecimiento visible.
. Basado en el uso de diluciones seriadas al doble de concentraciones de ABP de máxima a mínima (por ejemplo, de 128 μg/ml, 64 μg/ml, etc. a 0,5 μg/ml, 0,25 μg/ml y 0,125 μg/ml) .
. Se llevan a cabo en medios nutritivos líquidos y agar. Método de diluciones seriadas en medio nutritivo líquido (caldo).
Hay 2 opciones para este método:
macrométodo (tubo de ensayo) y micrométodo (placa).
Método macro.
. La prueba se realiza en tubos de ensayo en un volumen final de 1 ml por cada dilución.
. Se vierten 0,5 ml de caldo nutritivo en cada tubo de ensayo. El número de tubos está determinado por el rango de dilución requerido del ABP.
. Preparación de una suspensión de los microorganismos estudiados:
- Se prepara una suspensión de trabajo (~ 10 6 UFC/ml) a partir de una suspensión estándar de cada microorganismo en estudio (~ 10 8 UFC/ml). Preparación de diluciones dobles en serie de ABP: - preparar una solución madre de ABP del medicamento genérico de prueba y del medicamento de referencia (original) en una concentración de 1000 μg/ml y superior (teniendo en cuenta el contenido de la sustancia activa) . - a partir de las soluciones básicas de ABP del medicamento genérico en estudio y del medicamento de referencia (original), se preparan soluciones de trabajo de ABP utilizando un medio nutritivo líquido. (La concentración de las soluciones de trabajo se calcula en función de la concentración máxima requerida en una serie de diluciones en serie, teniendo en cuenta el factor de dilución durante la inoculación posterior con una suspensión del microorganismo) - se preparan diluciones en serie: 0,5 ml de la solución de trabajo de Se añade ABP al primer tubo de ensayo que contiene 0,5 ml de caldo. Remover. Usando una pipeta nueva (punta), transfiera 0,5 ml de solución ABP en caldo a un segundo tubo de ensayo que contenga 0,5 ml de caldo, etc., hasta que se haya preparado toda la serie de diluciones requerida. Se retiran 0,5 ml del último tubo. Así, se obtienen una serie de tubos de ensayo con soluciones ABP, cuyas concentraciones difieren 2 veces en los tubos de ensayo vecinos. Inoculación: a cada tubo de ensayo se le añaden 0,5 ml de una suspensión microbiana con una concentración de microorganismos de ~ 10 6 con 0,5 ml de una dilución adecuada de ABP. La concentración final del microorganismo en cada tubo es ~ 5x10 5 UFC/ml. . Control: un tubo de ensayo con caldo y un cultivo de microorganismos (control de crecimiento). Control negativo: un tubo con caldo (control de esterilidad). . Incubación: Todos los tubos, sellados con tapones o tapas, se incuban en condiciones que aseguren el crecimiento de los microorganismos de prueba. . Registro e interpretación de resultados: los tubos de ensayo con cultivos se observan en luz transmitida. Se compara el crecimiento del cultivo en el tubo de ensayo con ABP con el del tubo de control. - la presencia de crecimiento de microorganismos en el caldo (enturbiamiento del caldo) indica que esta concentración del antibiótico es insuficiente para suprimir su viabilidad. - a medida que aumenta la concentración del antibiótico, empeora el crecimiento del microorganismo. La primera concentración más baja del antibiótico (de una serie de diluciones seriadas), donde el crecimiento bacteriano no se determina visualmente, se considera la concentración mínima inhibidora (CIM). medicamentos Terapia antibacteriana: compare los resultados obtenidos para el medicamento original y el medicamento genérico estudiado. Se llega a una conclusión sobre su equivalencia en cuanto al espectro (lista de microorganismos utilizados) y al grado de actividad antimicrobiana (valores CMI).

. Determinación de MBC: de los últimos tubos con retraso del crecimiento, inocular con un asa en los sectores de una placa de Petri. El MBC, que suele ser varias diluciones menor que el MIC, se considera la concentración del fármaco en el último tubo de ensayo cuyo cultivo no produjo crecimiento. . Desventaja del método: bajo rendimiento- la aplicación se limita a estudios de un pequeño número de microorganismos.
micrométodo
.El procedimiento de prueba es similar al que se utiliza con el macrométodo.
.El volumen final es de hasta 0,2 ml. Disponibilidad de equipo de laboratorio adecuado: se pueden agregar previamente a los pocillos de la placa una placa de 96 pocillos con tapas estériles y pipetas multicanal, que luego se almacenan selladas. en polietileno a una temperatura inferior a 60°C hasta el momento de su uso. . Ventajas del método: - alta productividad - posibilidad de almacenamiento a largo plazo de tabletas preparadas - ahorro en consumibles. Publicado en ref.rf
Método de diluciones seriadas en medio agar. El principio de la prueba es similar al método de dilución en caldo. Preparación de una suspensión de microorganismos problema: - una suspensión estándar de cada microorganismo problema debe contener ~ 10 8 UFC/ml. - la suspensión microbiana estándar para el experimento se diluye ~ 10 veces para obtener una concentración de microorganismos de ~ 10 7 UFC/ml. La preparación de diluciones seriadas dobles de ABP para el medicamento original y el medicamento genérico en investigación se lleva a cabo de manera similar al método de diluciones en caldo. El medio agar se funde y se enfría a una temperatura de 45-50°C. . Preparación de placas con medio agar y diluciones ABP: mezclar el medio agar y las soluciones ABP directamente en una placa de Petri (para placas de plástico con un diámetro de 90 mm, añadir 18 ml de agar derretido y enfriado a 2 ml de solución ABP). . Inoculación e incubación: se utiliza un asa bacteriológica para transferir 1-2 µl de una suspensión de los microorganismos en estudio a la superficie del medio agar. Por tanto, la dosis final de inóculo es ~10 4 UFC (un asa bacteriológica estándar con un diámetro de 3 mm transporta 1-2 µl de líquido). . En la superficie del agar se forma una mancha con un diámetro de 5-8 mm. Después del secado, las placas se voltean y se incuban en condiciones favorables para el crecimiento de los microorganismos en estudio. . Registro e interpretación de resultados: similar al método de dilución en caldo. Las placas de Petri se colocan sobre una superficie oscura y no reflectante. La concentración de ABP que causó la inhibición completa del crecimiento visible se toma como MIC. . Control: placas de agar inoculadas con una suspensión de cultivos de microorganismos sin ABP (control de crecimiento). Control negativo: placas de agar (control de esterilidad). Ventajas del método: se puede determinar la sensibilidad de varios microorganismos en una placa.

Alcance de la investigación sobre la evaluación comparativa de la actividad antimicrobiana in vitro de agentes antimicrobianos genéricos y originales.

Alcance de la investigación sobre la evaluación comparativa de la actividad antimicrobiana in vitro de medicamentos antimicrobianos genéricos:
.Objetivo del estudio: confirmación de la conformidad del medicamento genérico con la referencia (original) en términos de espectro (microorganismos) y grado (CIM, valor MBC) de actividad antimicrobiana.
.Conjunto de microorganismos testados: 1-2 cepas de cada microorganismo incluido en el espectro de acción
- cepas de colección de referencia
- cepas clínicas aisladas en hospitales
.Se determinan los valores de MIC y MBC.
.Control: medicamento de referencia - medicamento original
Resultado esperado: la MIC y MBC de los medicamentos antimicrobianos genéricos desarrollados se encuentran dentro de los rangos de valores aceptables y coinciden completamente con la MIC y MBC de los medicamentos de referencia (medicamentos originales) en relación con la colección y las cepas clínicas.
El procedimiento para los estudios para determinar la actividad antimicrobiana in vitro de nuevos compuestos antimicrobianos:
.Evaluación primaria de la sensibilidad a nuevos compuestos de cepas de referencia. varios tipos microorganismos gramnegativos y grampositivos (4-5 cepas por cada especie);
.Estudio detallado del grado de actividad antibacteriana de compuestos contra cepas de microorganismos gramnegativos y grampositivos de colecciones internacionales con mecanismos de resistencia conocidos (método de dilución en serie);
.Estudio de la actividad contra cepas clínicas de microorganismos oportunistas y patógenos en comparación con fármacos conocidos de un grupo químico similar o de efecto antimicrobiano similar:
- en caso de actividad predominante contra microorganismos grampositivos, control - penicilinas naturales, cefalosporinas de primera y segunda generación, macrólidos, lincosamidas; - para actividad contra microorganismos gramnegativos, control - polimixina B, aztreonam; -para drogas amplia gama control de acción: penicilinas semisintéticas, aminoglucósidos, tetraciclinas, cefalosporinas de III - IV generaciones.
. Evaluación de la actividad antimicrobiana contra patógenos problemáticos: estafilococos resistentes a meticilina, Streptococcus pneumoniae resistente a bencilpenicilina, enterobacterias multirresistentes, bacterias del género Pseudomonas resistentes a aminoglucósidos, etc.
.Las concentraciones terapéuticas iniciales de los nuevos fármacos se establecen teniendo en cuenta la toxicidad determinada en experimentos que estudian la toxicidad aguda;
. El grado comparativo de actividad antibacteriana de los fármacos se evalúa mediante el valor MIC o MBC, determinado en al menos 2 valores de la dosis de semilla: mínimo - 10 4 - 10 5 UFC/ml y máximo - 10 6 - 10 9 UFC /ml, según el tipo de patógeno; Hasta la fecha, no existen métodos que permitan predecir con absoluta certeza el efecto clínico de los antibióticos en el tratamiento de enfermedades infecciosas. Sin embargo, estos resultados de sensibilidad pueden servir como una buena guía para que los médicos seleccionen y ajusten la terapia antibacteriana.

Conferencia, resumen. Métodos para determinar la sensibilidad de los microorganismos a los antibióticos: concepto y tipos. Clasificación, esencia y características.

Libro índice abrir cerrar

1. Microbiología farmacéutica. Materia y tareas de la microbiología farmacéutica.
2. Farmacia y productos farmacéuticos: historia de origen y desarrollo.
3. Medicina: definición, clasificación.
4. Composición de los medicamentos | Sustancia farmacéutica, excipiente.
5. Medicamentos originales y genéricos. Nombre de los medicamentos.




10. Efecto de factores dañinos sobre los microorganismos. La influencia del factor temperatura y su uso en productos farmacéuticos.
11. Efecto de la radiación sobre los microorganismos, tipos de radiación.
12. Influencia de los factores químicos dañinos sobre los microorganismos.
13. Esterilización. Nivel de garantía de esterilidad (SAL). Criterios para elegir un método de esterilización.
14. Esterilización térmica y química.
15. Seguimiento de la eficacia de los dispositivos de esterilización.
16. Desinfección industrial
17. Desinfectantes y antisépticos. Requisitos para desinfectantes y antisépticos químicos.
18. Conservantes y su uso en la producción farmacéutica.

Índice del tema "Métodos para determinar la sensibilidad a los agentes antimicrobianos. Efectos secundarios de la terapia con antibióticos":

Nuevos métodos para determinar la sensibilidad de las bacterias a la quimioterapia. Sistemas automáticos de registro de los resultados del método de dilución en serie. Prueba electrónica.

Actualmente sistemas computarizados desarrollados, realizando automáticamente aislamiento de bacterias a partir de muestras de prueba y determinar su sensibilidad a diversas drogas. Su principal ventaja es la liberación del personal del laboratorio bacteriológico de un gran volumen de investigaciones de rutina y una clara estandarización de los resultados obtenidos.

El uso generalizado de estos dispositivos en la práctica doméstica limita su coste. Entre los métodos más accesibles, los más extendidos son sistema alamar Y prueba electrónica, combinando las ventajas del método de dilución en serie y el método en disco.

Nuevos métodos para determinar la sensibilidad de las bacterias a la quimioterapia. Sistemas automáticos contabilización de los resultados del método de dilución en serie">

Sistemas automáticos de registro de los resultados del método de dilución en serie.(por ejemplo, Baxter MicroScan AutoSCAN-4): sistemas de incubación automatizados con fotómetros incorporados que registran nefelométricamente el crecimiento de bacterias o su ausencia 24 horas después de la introducción de microorganismos en los pocillos de los micropaneles. El principio de funcionamiento se basa en tener en cuenta la diferencia en la densidad óptica del medio en pocillos donde hay crecimiento bacteriano y en pozos donde no hay crecimiento. Actualmente, se han desarrollado dispositivos (por ejemplo, VITEK) que proporcionan resultados en 4 a 10 horas.

sistema alamar Es un panel con pocillos, cada uno de los cuales contiene discos de papel de filtro que contienen diferentes concentraciones de agentes antimicrobianos e impregnados con el indicador Alamar Blue. Después de introducir bacterias en el pozo, el disco se vuelve azul y, a medida que crecen, su color cambia a rosa. El orden de colocación de los discos en los pocillos corresponde a diluciones seriadas dobles del fármaco. El último pocillo con un disco azul, que precede a los pocillos con discos rosados, corresponde a la CMI del fármaco.

prueba electrónica[del inglés elipse, elipse, ya que en presencia de sensibilidad, se forma una zona de inhibición del crecimiento de forma elíptica] - una modificación del método del disco, pero en lugar de este último, se utilizan tiras de papel de filtro impregnadas con varias concentraciones de medicamentos, cada una de estas zonas está señalizada apropiadamente. Las tiras se colocan sobre la superficie del agar. Si las bacterias son sensibles a la acción del fármaco, se forma una zona elipsoidal alrededor de las áreas de la tira que contienen sus concentraciones inhibidoras. Su forma se debe a la acción de varias concentraciones del fármaco a la vez. El MIC corresponde a la sección de la franja donde es atravesada por el límite de la zona de inhibición del crecimiento.